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Jena Bioscience:生物素(Biotin)和地高辛(Digoxin)

發布者:艾美捷科技    發布時間:2024-04-02     
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由于其的安全性、穩定性和便利性,半抗原生物素(Biotin)和地高辛(Digoxin)是用于生成用于原位雜交、基因表達分析或電泳遷移率變化實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assays,簡稱EMSA)的核酸探針的極為常見標簽之一。

這些標簽通過標記的核苷酸,可以直接(使用生物素化/地高辛化的核苷酸)或間接(通過合并帶有活性基團的核苷酸類似物,隨后進行生物素化/地高辛化)酶促反應引入到DNA和RNA中。隨后,生物素標記的探針可以通過與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的鏈霉親和素、堿性磷酸酶(AP)或熒光染料檢測,而地高辛化通常通過HRP或AP修飾的抗體來可視化。

對于大多數應用來說,生物素是首選標簽。然而,在某些情況下,生物樣本中內源性的生物素可能會干擾檢測,導致高背景或甚至假陽性。在這些情況下,建議使用地高辛,這是一種僅在洋地黃植物中存在的類固醇。

Biotin.png

  

核酸標記是通過體外聚合反應實現的,例如聚合酶鏈反應(PCR)。四種天然脫氧核苷酸(dNTPs)或核苷酸(NTPs)中的一種(或多種)被部分替換為帶有連接物的類似物,該連接物將標簽連接到核苷酸部分的特定位置。這要求核苷酸類似物與聚合酶以及目標序列兼容。由于這種兼容性取決于:1)被替換的核苷酸類型和連接物附著位置,2)連接物的類型(結構)以及連接物的長度。

理論上,可能存在非常多的類似物。然而,在實踐中,這被減少到一組已被證明對大多數都能產生良好標記結果的類似物。特別突出的類似物是在其5位被修飾的尿苷三磷酸,其次是5位被修飾的胞苷三磷酸,以及在7-去氮或N6位置有替換的腺苷三磷酸。關于連接物的類型(結構),脂肪族氨基烯丙基、炔丙基氨基和氨基己基連接物已被證明不會參與Watson-Crick堿基配對,因此能夠產生良好的雜交結果。

Watson-Crick.png

  

除了連接物的結構,連接物的實際長度也顯著影響探針的產量、標簽的結合以及標簽可視化的靈敏度和可重復性。一般來說,短連接物會產生豐富的探針產量,但可能會阻礙標簽的結合和/或探針表面標簽的充分可及性,而長連接物則會增加標簽對檢測試劑的可及性,但會導致探針產量降低。目標是在結合率和檢測效率之間達到合適的平衡,這通常通過使用11個原子或16個原子的連接物來實現。

Biotin-4-dUTP.png

Biotin-11-dUTP.png

Biotin-16-dUTP.png

Biotin-18-dUTP.png

在1 kb的PCR實驗中(使用1ng的λ DNA,將TTP替換為生物素-dUTP的比例為0-100%),隨后通過Southern Blotting和通過Streptadvidin-HRP檢測生物素(Biotin),標簽的結合顯著依賴于連接物的長度。雖然在這個特定的實驗中,4個原子和18個原子的連接物顯示出極弱的標記,但Biotin-11-dUTP和Biotin-16-dUTP顯示出顯著更高的靈敏度,并且能夠容忍更廣泛的dTTP替換范圍。



DNA/cDNA標記(DNA/cDNA Labeling):

通過標準的酶促技術,如聚合酶鏈反應(PCR)、缺口翻譯(Nick Translation)、引物延伸(Primer Extension)或末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase,簡稱TdT)介導的3'端標記和逆轉錄(cDNA探針),可以生成隨機和定點生物素化/地高辛化的DNA和cDNA探針。DNA探針標記主要通過PCR、缺口翻譯或引物延伸進行,并應用于原位雜交或DNA微陣列技術。3'端標記的典型應用包括TUNEL(凋亡的原位定位)或電泳遷移率變化實驗(EMSA)實驗。逆轉錄法標記cDNA通常用于基因表達分析的DNA實驗中。

cDNA Labeling.png

 

Jena Bioscience提供了多種具有不同連接體長度的半抗原標記的((d)d)NTP類似物,這使得能夠為特定應用選擇合適匹配的產品。


用于DNA標記的生物素化核苷酸:

DNA標記cDNA 標記
核苷酸貨號PCRNT引物延申3' 末端標記RT
dUTP
Biotin-11-dUTPNU-803-BIOX√1,2√2√2√2√2
C5 position
Biotin-16-dUTPNU-803-BIO16√1,2√2√2√2√2
C5 position
dCTP
Biotin-11-dCTPNU-809-BIOX√1,2√2√2√2√2
C5 position
Biotin-16-dCTPNU-809-BIO16√1√2√2√2√2
C5 position
Biotin-14-dCTPNU-956-BIO14-√2√2n/an/a
N4 position
dATP
Biotin-7-dATPNU-835-BIO-√2√2√-n/a
N6 position
Biotin-14-dATPNU-835-BIO14-√2√2n/an/a
N6 position
Desthiobiotin-7-dATPNU-835-Desthiobio-n/a√2n/an/a
N6 position
Biotin-11-dATPNU-1175-BIOX√1,2√2√2n/a√2
7-Deaza position
dGTP
Biotin-11-dGTPNU-1615-BIOXn/an/an/an/an/a
7-Deaza position
ddUTP
Biotin-11-ddUTPNU-1619-BIOX---√2-
C5 position
ddATP
Biotin-11-ddATPNU-1612-BIOX---√2-
7-Deaza position

 

用于DNA標記的地高辛/二硝基苯酚修飾的核苷酸:


DNA 標記cDNA 標記
核苷酸貨號PCRNT引物延申3' 末端標記RT
dUTP
Digoxigenin-11-dUTPNU-803-DIGX√1,2√1,2√2√2√2
C5 position
Aminoallyl-dUTP-DNPNU-803-DNP√1n/an/an/an/a
C5 position
ddUTP
Digoxigenin-11-ddUTPNU-1619-DIGX---√2-
C5 position


特殊備注說明:

PCR: Polymerase chain reaction with Taq Polymerase(Taq聚合酶的聚合酶鏈式反應);

NT: Nick Translation with DNAse I / DNA Polymerase I(DNA酶I/DNA聚合酶I的Nick翻譯);

Primer Extension: Primer Extension with Klenow 3'-5'exo-(Klenow 3'-5'exo-引物延伸法);

3'-End Labeling: Incorporation with Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)(摻入末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT));

RT: Reverse Transcription with Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (MMLV RT)(用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV RT)進行逆轉錄).

1: in-house tested(內部測試)

2: external reference (see datasheet)(外部參考(見數據表))

n/a: no data available(無資料)

- : not applicable(不適用) 

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Jena Bioscience成立于1998年,由德國馬普研究所(MPI)的分子生理學家共同創立。該生物公司致力于為全球科研機構、醫院、醫學院、制藥企業和診斷試劑盒生產企業提供各種研發和臨床前生物試劑。憑借其強大的科研實力和前沿的學術研究水平,Jena Bioscience已發展成為一個擁有完整生物試劑產品線、超過7500種產品的跨國企業,為全球50多個國家的客戶提供生物試劑服務。

Jena Bioscience的主要產品包括核苷/核酸制品系列(包括合成的類似物)、重組蛋白及蛋白表達系統、點擊化學產品系列、在結構學研究方面全面提供晶體篩選試劑盒、優化試劑、工具和各類耗材等。此外,還提供分子生物學和生物化學研究的定制試劑與研究服務。

武漢艾美捷科技有限公司,簡稱艾美捷,擁有進出口資質和自己的國際物流,與國內外90余家知名的試劑、原料及技術服務供應商深度合作,是國內生物制藥企業、診斷企業、跨國藥企、各大高校院所采購平臺的首選定供應商。

 


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